Дитиотреитол (DTT) - жаңа жасыл қоспа ретінде белгілі, жиі қолданылатын қалпына келтіретін агент.Бұл екі меркаптан тобы (-SH) бар шағын молекулалық органикалық қосылыс.Өзінің қалпына келтіретін қасиеттері мен тұрақтылығына байланысты DTT биохимия және молекулалық биология тәжірибелерінде кеңінен қолданылады.
DTT негізгі рөлі белоктардағы және басқа биомолекулалардағы дисульфидті байланыстарды азайту болып табылады.Дисульфидтік байланыс ақуыздың қатпарлануының және тұрақтылығының маңызды бөлігі болып табылады, бірақ белгілі бір тәжірибелік жағдайларда, мысалы, тотықсыздандырылатын SDS-PAGE талдауы, ақуыздың рекомбинациясы және қатпарлануы, дисульфидті байланыстың екі тиол тобына дейін төмендеуін қажет етеді. ақуыз.DTT дисульфидті байланыстармен әрекеттесіп, оларды меркаптан топтарына дейін төмендетеді, осылайша ақуыздың кеңістіктік құрылымын ашады және оны талдау мен өңдеуді жеңілдетеді.
DTT ферменттердің белсенділігі мен тұрақтылығын қорғау үшін де қолданылуы мүмкін.Кейбір ферменттер катализдейтін реакцияларда ферменттің белсенділігі тотықтырғыштың әсерінен төмендеуі мүмкін.DTT тотықтырғыштармен әрекеттесіп, оларды зиянсыз заттарға дейін төмендетеді, осылайша ферменттің белсенділігі мен тұрақтылығын қорғайды.
β-меркаптоэтанол (β-ME) сияқты дәстүрлі қалпына келтіретін агенттермен салыстырғанда, DTT қауіпсіз және тұрақты қалпына келтіретін агент болып саналады.Ол сулы ерітіндіде тұрақты болып қана қоймайды, сонымен қатар жоғары температурада және қышқыл-негіздік жағдайларда қалпына келтіру қасиеттерін сақтайды.
DTT қолдану салыстырмалы түрде қарапайым.Жалпы алғанда, DTT сәйкес буферде ерітіліп, содан кейін тәжірибелік жүйеге қосылады.DTT оңтайлы концентрациясы нақты тәжірибеге сәйкес анықталуы керек және әдетте 0,1-1мМ диапазонында қолданылады.Төменгі концентрациялар жасуша өсуіне жағымсыз әсерлерді азайтуы мүмкін және мақсатты ақуыздардың шамадан тыс экспрессиясына байланысты цитотоксикалық әсерді азайтуы мүмкін.Жоғары концентрациялар жасушаның өсуіне және экспрессияның тиімділігіне әсер ететін шамадан тыс жасушалық метаболикалық жүктемені тудыруы мүмкін.
Оңтайлы концентрацияны анықтау тәсілі әртүрлі концентрацияларда IPTG индукциялық сынақтарын жүргізу арқылы мақсатты ақуыздың экспрессия деңгейін бағалау болуы мүмкін.Шағын ауқымды культура сынақтары IPTG концентрацияларының ауқымын (мысалы, 0,1 мМ, 0,5 мм, 1 мМ және т.б.) пайдалана отырып орындалуы мүмкін және әртүрлі концентрациялардағы экспрессия әсерін мақсатты ақуыздың экспрессиялық деңгейін анықтау арқылы бағалауға болады (мысалы, Батыс дақ немесе флуоресценцияны анықтау).Тәжірибе нәтижелері бойынша ең жақсы экспрессиялық әсері бар концентрация оңтайлы концентрация ретінде таңдалды.
Бұған қоса, ұқсас эксперименттік жағдайларда жиі қолданылатын IPTG концентрациясының ауқымын түсіну үшін тиісті әдебиеттерге немесе басқа зертханалардың тәжірибесіне сілтеме жасай аласыз, содан кейін эксперименттік қажеттіліктерге сәйкес оңтайландырып, реттей аласыз.
Оңтайлы концентрация әртүрлі экспрессиялық жүйелерге, мақсатты белоктарға және тәжірибелік жағдайларға байланысты өзгеруі мүмкін екенін ескеру маңызды, сондықтан жеке жағдайда оңтайландырған дұрыс.
Қорытындылай келе, DTT - белоктардағы және басқа биомолекулалардағы дисульфидтік байланыстарды азайту және ферменттердің белсенділігі мен тұрақтылығын қорғау үшін қолданылатын жиі қолданылатын қалпына келтіретін агент.Ол биохимия және молекулалық биология эксперименттерінде кеңінен қолданылды.
Жіберу уақыты: 28 қыркүйек 2023 ж