Дитиотреитол (ДТТ) - кеңінен қолданылатын тотықсыздандырғыш, сонымен қатар жаңа жасыл қоспа ретінде де белгілі. Бұл екі меркаптан тобы (-SH) бар шағын молекулалық органикалық қосылыс. Тотықсыздандырғыш қасиеттері мен тұрақтылығына байланысты ДТТ биохимия және молекулалық биология тәжірибелерінде кеңінен қолданылады.
ДТТ-ның негізгі рөлі - ақуыздар мен басқа биомолекулалардағы дисульфидтік байланыстарды азайту. Дисульфидтік байланыс ақуыздың бүктелуінің және тұрақтылығының маңызды бөлігі болып табылады, бірақ белгілі бір тәжірибелік жағдайларда, мысалы, тотықсыздандырылатын SDS-PAGE талдауы, ақуыздың рекомбинациясы және бүктелуінде, ақуыздың кеңістіктік құрылымын ашу үшін дисульфидтік байланысты екі тиол тобына дейін азайту қажет. ДТТ дисульфидтік байланыстармен әрекеттесіп, оларды меркаптан топтарына дейін азайта алады, осылайша ақуыздың кеңістіктік құрылымын ашады және оны талдау мен манипуляциялауды жеңілдетеді.
ДТТ фермент белсенділігі мен тұрақтылығын қорғау үшін де қолданылуы мүмкін. Кейбір фермент катализдейтін реакцияларда ферменттің белсенділігі тотықтырғышпен төмендеуі мүмкін. ДТТ тотықтырғыштармен әрекеттесіп, оларды зиянсыз заттарға дейін тотықсыздандыра алады, осылайша ферменттің белсенділігі мен тұрақтылығын қорғайды.
β-меркаптоэтанол (β-ME) сияқты дәстүрлі тотықсыздандырғыштармен салыстырғанда, ДТТ қауіпсіз және тұрақты тотықсыздандырғыш болып саналады. Ол тек сулы ерітіндіде ғана емес, сонымен қатар жоғары температура мен қышқыл-негіз жағдайларында тотықсыздандырғыш қасиеттерін сақтайды.
ДТТ қолдану салыстырмалы түрде қарапайым. Жалпы алғанда, ДТТ тиісті буферде ерітіліп, содан кейін тәжірибелік жүйеге қосылады. ДТТ оңтайлы концентрациясын нақты тәжірибеге сәйкес анықтау қажет және әдетте 0,1-1 мМ диапазонында қолданылады. Төмен концентрациялар жасуша өсуіне жағымсыз әсерлерді азайтуы мүмкін және мақсатты ақуыздардың шамадан тыс экспрессиялануынан туындаған цитоуыттылықты төмендетуі мүмкін. Жоғары концентрациялар жасуша метаболизмінің шамадан тыс жүктемесін тудыруы мүмкін, бұл жасуша өсуі мен экспрессия тиімділігіне әсер етеді.
Оңтайлы концентрацияны анықтау жолы - әртүрлі концентрацияларда IPTG индукциялық сынақтарын жүргізу арқылы мақсатты ақуыздың экспрессия деңгейін бағалау. Шағын көлемді дақыл сынақтарын IPTG концентрацияларының диапазонын (мысалы, 0,1 мМ, 0,5 мМ, 1 мМ және т.б.) пайдаланып жүргізуге болады, ал әртүрлі концентрациялардағы экспрессия әсерін мақсатты ақуыздың экспрессия деңгейін анықтау арқылы бағалауға болады (мысалы, вестерн-блот немесе флуоресценцияны анықтау). Тәжірибелік нәтижелерге сәйкес, ең жақсы экспрессия әсері бар концентрация оңтайлы концентрация ретінде таңдалды.
Сонымен қатар, ұқсас тәжірибелік жағдайларда жиі қолданылатын IPTG концентрация диапазонын түсіну үшін тиісті әдебиеттерге немесе басқа зертханалардың тәжірибесіне сілтеме жасай аласыз, содан кейін тәжірибелік қажеттіліктерге сәйкес оңтайландырып, реттей аласыз.
Оңтайлы концентрация әртүрлі экспрессия жүйелеріне, нысана ақуыздарына және эксперименттік жағдайларға байланысты өзгеруі мүмкін екенін ескеру маңызды, сондықтан әр жағдайды жеке-жеке оңтайландырған дұрыс.
Қорытындылай келе, ДТТ - ақуыздар мен басқа биомолекулалардағы дисульфидтік байланыстарды азайту және ферменттердің белсенділігі мен тұрақтылығын қорғау үшін қолданылатын кең таралған тотықсыздандырғыш агент. Ол биохимия және молекулалық биология тәжірибелерінде кеңінен қолданылды.
Жарияланған уақыты: 2023 жылғы 28 қыркүйек