IPTG (изопропил-β-D-тиогалактозид) β-галактозидаза субстратының аналогы болып табылады, ол жоғары индукцияланады.IPTG индукциясы кезінде индуктор репрессорлық протеинмен кешен құра алады, осылайша репрессорлық ақуыздың конформациясы өзгереді, сондықтан ол мақсатты генмен біріктірілмейді және мақсатты ген тиімді экспрессияланады.Сонымен, эксперимент кезінде IPTG концентрациясын қалай анықтау керек?Үлкенірек соғұрлым жақсы ма?
Алдымен IPTG индукциясының принципін түсінейік: E. coli лактоза опероны (элементі) сәйкесінше β-галактозидазаны, пермеазаны және ацетилтрансферазаны кодтайтын үш құрылымдық генді, Z,Y және A гендерін қамтиды.lacZ лактозаны глюкоза мен галактозаға немесе алло-лактозаға гидролиздейді;lacY қоршаған ортадағы лактозаның жасуша мембранасынан өтуіне және жасушаға енуіне мүмкіндік береді;lacA ацетил тобын ацетил-КоА-дан β-галактозидке ауыстырады, бұл токсикалық әсерді жоюды қамтиды.Сонымен қатар, О операциялық тізбегі, Р бастапқы тізбегі және реттеуші ген I бар. I гендік коды оператор тізбегінің O позициясымен байланыса алатын репрессорлық ақуыз болып табылады, осылайша оперон (мета) басылады және өшірілген.Сондай-ақ катаболикалық ген активаторы ақуыз-CAP байланыстыру орны P инициаторлық тізбегінің жоғары жағында байланыстырушы орын бар. P тізбегі, O тізбегі және CAP байланыстыру орны бірге лак оперонының реттеуші аймағын құрайды.Үш ферменттің кодтаушы гендері ген өнімдерінің келісілген экспрессиясына жету үшін бір реттеуші аймақпен реттеледі.
Лактоза болмаған кезде лак опероны (мета) репрессия күйінде болады.Осы уақытта PI промотор тізбегінің бақылауындағы I тізбегімен өрнектелген лак репрессоры О тізбегімен байланысады, ол РНҚ-полимеразаның Р тізбегімен байланысуын болдырмайды және транскрипция инициациясын тежейді;лактоза болған кезде лак опероны (мета) индукциялануы мүмкін Бұл оперон (мета) жүйесінде нақты индуктор лактозаның өзі емес.Лактоза жасушаға еніп, аллолактозаға айналу үшін β-галактозидазамен катализденеді.Соңғысы индуктор молекуласы ретінде репрессор ақуызымен байланысады және белок конформациясын өзгертеді, бұл репрессор ақуызының О тізбегінен және транскрипциядан диссоциациялануына әкеледі.Изопропилтиогалактозид (IPTG) аллолактоза сияқты әсер етеді.Бұл бактериялар арқылы метаболизденбейтін және өте тұрақты болатын өте күшті индуктор, сондықтан ол зертханаларда кеңінен қолданылады.
IPTG оңтайлы концентрациясын қалай анықтауға болады?Мысал ретінде E. coli алайық.
Құрамында оң рекомбинантты pGEX (CGRP/msCT) бар E. coli BL21 гендік-инженерлік штаммы құрамында 50 мкг·мЛ-1 амп бар LB сұйық ортаға егілді және түні бойы 37°C температурада өсірілді.Жоғарыда көрсетілген культура кеңейту мәдениеті үшін 1:100 қатынасында 50мкг·мЛ-1 Амп бар 50 мл жаңа LB сұйық ортаға 10 бөтелкеге егілді және OD600 мәні 0,6~0,8 болғанда, IPTG соңғы концентрацияға қосылды.Ол 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0ммоль·Л-1.Бірдей температурада және бір уақытта индукциядан кейін одан 1 мл бактериалды ерітінді алынды, ал бактерия жасушалары центрифугалау арқылы жиналды және әртүрлі IPTG концентрацияларының ақуыз экспрессиясына әсерін талдау үшін SDS-PAGE жүргізілді, содан кейін ең үлкен белок экспрессиясы бар IPTG концентрациясын таңдаңыз.
Тәжірибелерден кейін IPTG концентрациясы мүмкіндігінше үлкен емес екендігі анықталады.Бұл IPTG бактерияларға белгілі бір уыттылыққа ие болғандықтан.Концентрациядан асып кету жасушаны да өлтіреді;және жалпы айтқанда, жасушада еритін ақуыз неғұрлым көп болса, соғұрлым жақсы деп үміттенеміз, бірақ көптеген жағдайларда IPTG концентрациясы тым жоғары болғанда, көп мөлшерде инклюзия түзіледі.Дене, бірақ еритін ақуыздың мөлшері азайды.Сондықтан ең қолайлы IPTG концентрациясы көбінесе үлкен емес, соғұрлым жақсы, бірақ концентрация неғұрлым төмен.
Гендік-инженерлік штаммдарды индукциялау және өсірудің мақсаты мақсатты ақуыздың шығымдылығын арттыру және шығындарды азайту болып табылады.Мақсатты геннің экспрессиясына тек штаммның меншікті факторлары және экспрессия плазмидасы ғана емес, сонымен қатар индуктордың концентрациясы, индукция температурасы және индукция уақыты сияқты басқа сыртқы жағдайлар да әсер етеді.Сондықтан, жалпы алғанда, белгісіз белокты экспрессиялау және тазарту алдында, сәйкес шарттарды таңдау және ең жақсы тәжірибе нәтижелерін алу үшін индукция уақытын, температураны және IPTG концентрациясын зерттеген дұрыс.
Жіберу уақыты: 31 желтоқсан 2021 ж