IPTG (изопропил-β-D-тиогалактозид) - β-галактозидаза субстратының аналогы, ол жоғары индукцияланады. IPTG индукциясы кезінде индуктор репрессор ақуызымен кешен түзе алады, осылайша репрессор ақуызының конформациясы өзгереді, сондықтан оны нысана генімен біріктіру мүмкін емес және нысана гені тиімді түрде экспрессияланады. Сонымен, тәжірибе кезінде IPTG концентрациясын қалай анықтау керек? Неғұрлым үлкен болса, соғұрлым жақсы?
Алдымен, IPTG индукциясының принципін түсінейік: E. coli лактоза опероны (элементі) құрамында β-галактозидаза, пермеаза және ацетилтрансферазаны кодтайтын үш құрылымдық ген, Z, Y және A бар. lacZ лактозаны глюкоза мен галактозаға немесе алло-лактозаға гидролиздейді; lacY қоршаған ортадағы лактозаның жасуша мембранасы арқылы өтіп, жасушаға енуіне мүмкіндік береді; lacA ацетил тобын ацетил-КоА-дан β-галактозидке тасымалдайды, бұл уытты әсерді жоюды қамтиды. Сонымен қатар, жұмыс тізбегі O, бастапқы тізбек P және реттеуші ген I бар. I ген коды - оператор тізбегінің O позициясына байланыса алатын репрессор ақуызы, сондықтан оперон (мета) репрессияланып, өшіріледі. Бастамалық P тізбегінің жоғары жағында катаболикалық ген активаторы ақуыз-CAP байланысу орны үшін байланыс орны да бар. P тізбегі, O тізбегі және CAP байланысу орны бірге lac оперонының реттеуші аймағын құрайды. Үш ферменттің кодтаушы гендері ген өнімдерінің үйлесімді экспрессиясына қол жеткізу үшін бір реттеуші аймақпен реттеледі.
Лактоза болмаған кезде лактоза опероны (мета) репрессия күйінде болады. Бұл кезде PI промотор тізбегінің бақылауымен I тізбегімен экспрессияланған лактоза репрессоры O тізбегімен байланысады, бұл РНҚ полимеразасының P тізбегіне байланысуына кедергі келтіреді және транскрипцияның басталуын тежейді; лактоза болған кезде лактоза опероны (мета) индукциялануы мүмкін. Бұл оперон (мета) жүйесінде нақты индуктор лактозаның өзі емес. Лактоза жасушаға енеді және β-галактозидазамен катализденіп, аллолактозаға айналады. Соңғысы, индуктор молекуласы ретінде, репрессор ақуызымен байланысады және ақуыз конформациясын өзгертеді, бұл репрессор ақуызының O тізбегінен және транскрипциядан диссоциациялануына әкеледі. Изопропилтиогалактозид (IPTG) аллолактозамен бірдей әсер етеді. Бұл бактериялармен метаболизденбейтін және өте тұрақты өте күшті индуктор, сондықтан ол зертханаларда кеңінен қолданылады.
IPTG оңтайлы концентрациясын қалай анықтауға болады? Мысал ретінде E. coli-ді алайық.
Оң рекомбинантты pGEX (CGRP/msCT) бар E. coli BL21 генетикалық түрлендірілген штаммы 50 мкг·мл-1 ампер бар LB сұйық ортасына егіліп, 37°C температурада түні бойы өсірілді. Жоғарыда аталған дақыл кеңейту дақылы үшін 1:100 қатынасында 50 мкг·мл-1 ампер бар 10 бөтелкедегі 50 мл жаңа LB сұйық ортасына егілді, ал OD600 мәні 0,6~0,8 болғанда, IPTG соңғы концентрацияға қосылды. Ол 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 ммоль·л-1 құрайды. Сол температурада және сол уақытта индукциядан кейін одан 1 мл бактериялық ерітінді алынды, ал бактериялық жасушалар центрифугалау арқылы жиналып, ақуыз экспрессиясына әртүрлі IPTG концентрацияларының әсерін талдау үшін SDS-PAGE әдісіне ұшырады, содан кейін ақуыз экспрессиясы ең жоғары IPTG концентрациясын таңдады.
Тәжірибелерден кейін IPTG концентрациясының мүмкін болатындай үлкен емес екені анықталады. Себебі IPTG бактерияларға белгілі бір уыттылыққа ие. Концентрациядан асып кету жасушаны да өлтіреді; және жалпы алғанда, жасушада неғұрлым көп еритін ақуыз болса, соғұрлым жақсы деп үміттенеміз, бірақ көп жағдайда IPTG концентрациясы тым жоғары болған кезде көп мөлшерде қоспа пайда болады. Дене, бірақ еритін ақуыз мөлшері азаяды. Сондықтан, ең қолайлы IPTG концентрациясы көбінесе неғұрлым үлкен болса, соғұрлым жақсы емес, керісінше төмен болады.
Гендік-инженерлік штамдарды индукциялау және өсірудің мақсаты - мақсатты ақуыздың өнімділігін арттыру және шығындарды азайту. Мақсатты геннің экспрессиясына тек штаммның өз факторлары мен плазмиданың экспрессиясы ғана емес, сонымен қатар индуктордың концентрациясы, индукция температурасы және индукция уақыты сияқты басқа да сыртқы жағдайлар әсер етеді. Сондықтан, жалпы алғанда, белгісіз ақуыз экспрессияланып, тазартылмас бұрын, тиісті жағдайларды таңдау және ең жақсы тәжірибелік нәтижелерді алу үшін индукция уақытын, температурасын және IPTG концентрациясын зерттеген дұрыс.
Жарияланған уақыты: 2021 жылғы 31 желтоқсан